有许多不同类型的荧光探针和引物化学试剂可用于qPCR，但大多数依赖于某种形式的共价连接的荧光淬灭基团分子，该分子在特定目标序列存在时被释放。
与嵌入染料不同，探针是特异性的，因此必须为每个检测设计，增加了检测设置的复杂性和成本。然而，这确实意味着它们也提高了检测的特异性。
不同的探针通过使用不同的荧光基团可以发出不同波长的荧光，因此只要选择了兼容的探针，并且设备拥有所需的过滤器，它们就可以被复用。
虽然最初的检测开发时间可能更长、更复杂，但多路复用可以通过在一个孔中进行多项测试来减少后续的设置时间和试剂使用。
常见的荧光探针包括：
01 水解探针水解探针，也叫TaqMan或5'核酸酶，是最常用的探针类型之一，水解探针包括一个序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针，一端是荧光基团，另一端是淬灭基团。
当完整时，淬灭基团会抑制荧光信号。在目标扩增过程中，某些聚合酶的5'到3'外切酶活性会裂解探针，因此荧光基团不再靠近淬灭基团，从而产生荧光信号（图4）。
图4 水解探针的工作原理
荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）显示为紫色，目标DNA为灰色，扩增序列为黄色（粗线），引物为黄色（细线）。
02 分子信标与水解探针一样，分子信标是序列特定的荧光标记的寡核苷酸探针。然而，它们的两端附近有赠送的碱基（5或6个），形成一个发夹结构，使淬灭基团靠近荧光基团并淬灭信号。
当探针与目标序列结合时，茎部变性，使荧光基团和淬灭基团分开，从而产生信号（图5）。由于其结构，分子信标探针比水解探针更难设计。
图5 分子信标的工作原理
荧光基团（R）显示为绿色，淬灭基团（Q）为紫色，目标DNA为灰色，引物为黄色。
03 双重杂交探针双重杂交探针也被称为LightCycler或FRET探针，这种技术使用一对探针，旨在结合相邻的序列，用供体荧光基团和受体荧光基团对标记，表现出荧光共振能量转移（FRET）。当探针与它们的目标序列结合时，供体和受体染料接近，发生FRET，受体发出荧光（图6）。
图6 双杂交探针的工作原理
供体荧光基团（R1）显示为粉红色，受体荧光基团（R2）为绿色，目标DNA为灰色，引物为黄色。
04 小凹槽结合剂（MGB）探针小凹槽结合剂（MGB）探针也被称为Eclipse探针，它们像水解探针一样在两端有一个荧光